协议
避免污染
角蛋白的问题
角蛋白污染几乎总是作为背景蛋白被观察到。只戴丁腈手套，用HPLC级的水冲洗所有接触凝胶的托盘、容器和表面(包括手套、染色托盘、解剖刀、刀片、灯箱和切割区)。
强烈建议使用新鲜制备的溶液/缓冲液进行质谱分析。
其他污染
其他常见的污染蛋白包括干奶中的酪蛋白和牛血清蛋白、培养基和/或生物实验室常用的血清。通过对细胞颗粒、玻璃器皿和托盘进行大量清洗，可以将这些蛋白质污染降至最低。
其它污染可能由洗涤剂、PPG和/或PEG引起的聚合物引起。因此，在被消化用于质谱分析的样品中不应存在洗涤剂。需要注意的是，许多肥皂和护手霜都含有聚乙二醇，所以刚洗过或涂过奶油的手接触管子、托盘或凝胶时，会产生聚合物污染。
蛋白质沉淀
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以糖原为载体的乙醇沉淀
- 向样品中加入糖原，最终浓度为20 ug/ml(糖原不影响后续的SDS-PAGE)。
- 加入醋酸钠，最终浓度为0.1 M, pH为5。
- 加入3体积的乙醇。
- 漩涡。
- 静置2-3小时。
- 不应该有任何可见的沉淀!
- 以每分钟14公里的速度旋转10分钟。
- 用70%乙醇清洗颗粒。
- 将颗粒溶解在缓冲液中。
注:如果在离心前总混合物中有明显的沉淀，说明:a.蛋白溶液中盐过多;B.由于不溶性，一些蛋白质(-s)会丢失。为了避免这个问题:
省略醋酸钠。
将蛋白混合物的盐浓度降至300-400mM NaCl。
以脱氧胆酸为载体的TCA沉淀
- 在Eppendorf试管中用水稀释蛋白至500 ul
- 地址:50ul DOC, 25 ul Triton x100, 80 ul TCA (13% TCA)
- 在冰上孵育至少2小时
- 在4°C的台式微熔体中旋转30分钟，14000 rpm。
- 在管子的侧面会有一个片状的小球
- 取出上清液，将试管倒置放在KimWipe纸巾上，让试管立起来，以去除大部分液体。
- 加入500ul乙醇/乙醚或冷丙酮。在超声波浴中对样品进行超声波处理，以彻底破坏颗粒。
- 在冰上孵育30分钟
- 重复步骤4
- 几乎没有子弹了
- 重复步骤6
- 让空气在室温下干燥
- 先在5 ul样品运行缓冲液中重悬样品，然后在20 ul样品缓冲液中65°C孵育15分钟。
- 加载样品，运行凝胶…
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在溶液中消化
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对于溶液中消化和随后的质谱分析，样品应不含任何洗涤剂(SDS, Triton X100, NP-40等)。一旦投保，可以使用以下协议:
应调整溶液的pH值，使其介于7.2至8.5之间。
将胰蛋白酶添加到样品溶液中，使酶与底物的比例在1:50到1:10之间。
37°C孵育4至8小时。如果变性，减少ss键，和烷基化的自由硫醇基团是必要的，我们建议以下协议:
沉淀蛋白质(见下文)
在8 M尿素，50 mM碳酸氢铵，20 mM DTT中重新溶解蛋白质。
56°C孵育30分钟。
冷却至室温。
加入碘乙酰胺溶液，终浓度为100 mM，室温黑暗孵育20分钟。
使用Pierce (MWCO 3500)的Slide-A-Lyzer MINI透析设备，将溶液与10毫米碳酸氢铵进行透析过夜。
根据蛋白质浓度的不同，可以直接向样品溶液中加入胰蛋白酶，使酶与底物的比例在1:50到1:10之间，也可以快速溶解样品，在50mm碳酸氢铵中再溶解蛋白质，同时加入适量的胰蛋白酶。
37°C孵育4至8小时。
SDS-PAGE前的溶液还原/烷基化
向样品缓冲液中加入DTT，最终浓度为20mm(确保不包含额外的DTT或bME)
65°C孵育20分钟。
冷却至室温。
加入碘乙酰胺终浓度为100 mM，室温黑暗中孵育20分钟
如果溴酚蓝的颜色变成绿色/黄色，添加一微升1M Hepes或Tris (pH 7.5至8.8)来调整pH。
加载并运行凝胶…
或者，可以使用以下协议:
向样品缓冲液中加入DTT，最终浓度为20mm(确保不包含额外的DTT或bME)。
65°C孵育20分钟。
冷却至室温。
向样品体积中加入终浓度为1%的丙烯酰胺溶液。
室温孵育20分钟
加载并运行凝胶…
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凝胶染色
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有许多不同的染色方法可用于随后的蛋白水解消化和质谱分析。多采用考马斯氏染色法、银染色法或荧光染料染色法，如Sypro Ruby或Sypro Orange。虽然考马斯氏染色简单廉价，但灵敏度有时不够。银染色克服了Coomasssie染色的敏感性限制，但相当繁琐。荧光Sypro染料结合了考马斯氏染色的简易性和银染色的敏感性。然而，这些方法的缺点是相当昂贵，荧光扫描仪是成像的先决条件，切除感兴趣的凝胶塞/带需要例如手持UV灯。无论使用何种染色方法，在染色过程中，至关重要的是不要将蛋白质不可逆地固定在凝胶中;这种考虑尤其适用于一些“传统的”银染色方案，使用戊二醛或甲醛进行固定和显影，这将使凝胶与后续的质谱分析不兼容。下面给出了各种质谱兼容的银染色协议。
我们拥有大量商业考马斯氏染色试剂盒的良好经验，包括Pierce公司的GelCode Blue Stain, Bio-Rad公司的Bio-Safe考马斯氏染色试剂盒和Invitrogen公司的胶体蓝染色试剂盒。一般的考马斯氏染色方法如下。如果使用商用套件，我们强烈建议遵循制造商的协议。
Coomassie染色
不要用裸露的皮肤接触凝胶，始终佩戴手套。
从卡带中取出凝胶，用ddH2O冲洗缓冲液。
用45%甲醇，10%乙酸和45% H2O固定凝胶15到60分钟。
用ddH2O冲洗凝胶5分钟，重复2次。
用考马斯蓝溶液覆盖凝胶。轻轻摇晃3小时。
用ddH2O冲洗凝胶5分钟，重复2次。
用45%甲醇，10%乙酸和45% H2O过夜去渍。
用ddH2O冲洗凝胶5分钟，重复2次。
用干净的保鲜膜包裹凝胶。获取凝胶图像可以用扫描仪完成。
将凝胶储存在1%的醋酸中或0.02 %的叠氮化钠中ddH2O中。
银染色
不要用裸露的皮肤接触凝胶，始终佩戴手套。
从卡带中取出凝胶，用ddH2O冲洗缓冲液。
用45%甲醇，10%乙酸和45% H2O固定凝胶15到60分钟。
把它放在晃动的平台上，在水中浸泡一小时。
延长洗涤时间有助于消除通常在长时间凝胶显影后观察到的泛黄背景(参见本方案的步骤6)。
用0.02%硫代硫酸钠敏化凝胶1 - 2分钟。
轻轻搅拌，确保凝胶板被均匀覆盖。
丢弃溶液，快速用两次换水冲洗凝胶板(每次10秒)。在4°C(冰箱)的0.1%硝酸银中培养凝胶30分钟。
丢弃硝酸银溶液，快速换两次水冲洗凝胶(每次30秒)。
用新鲜的0.04%甲醛和2%的碳酸钠*配制凝胶。
显影液一变黄就扔掉，用新鲜的部分代替。
当染色达到一定程度时，弃去显现液，用1%醋酸替代。
用1%醋酸洗涤几次，并储存在同一溶液中。
或者，凝胶可以存储在0.02%的NaN3(叠氮化钠)ddH2O中。
注意:在某些情况下，染色蛋白条带的颜色可能会随时间发生轻微变化。但是这些变化并不影响质谱测序的结果。
更多细节，见Blum等人，电泳，8,pp93-99, 1987和Schevchenko, A. et al. (1996) Anal。68年化学,850 - 858。
SYPRO Ruby染色
使用塑料托盘作为染色容器。
用ddH2O冲洗凝胶3次。
用10%甲醇，7%乙酸和83% ddH2O固定凝胶60分钟。
用SYPRO染色凝胶
红宝石溶液至少是凝胶体积的10倍。
轻轻摇动至少3小时，以达到最大的灵敏度，或整夜。
用10%甲醇、7%醋酸和83% ddH2O洗涤凝胶30-60分钟，以降低背景荧光。
用ddH2O洗涤凝胶3-5分钟。
在蓝光转照器下获得凝胶图像(图像可以通过手持紫外光源看到)。
将凝胶储存在1 - 2%的醋酸或0.02%的叠氮化钠中。
注:SYPRO红宝石是乙二醇和脂蛋白的次优选择。
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删除凝胶乐队
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用水冲洗凝胶。
用干净的手术刀切除感兴趣的带。
剪到尽可能靠近带的边缘，以减少“背景”凝胶的数量。
将切下的条带切成大约1 × 1毫米的小块，将凝胶颗粒转移到0.5 ul的微离心管中。
不要浸渍凝胶带/胶塞。
减少凝固态/烷基化
用100-150uL的水清洗凝胶颗粒(5分钟)。
旋涡，旋转凝胶颗粒，丢弃液体。
加入乙腈(约相当于凝胶块总体积的3 - 4倍)，孵育10 - 15分钟，直至凝胶块收缩、变不透明并粘在一起。
旋转凝胶颗粒，丢弃所有液体。
将凝胶块放入50mm碳酸氢铵的10mm DTT中膨胀，在56°C孵育30分钟以减少蛋白质。
旋转凝胶颗粒，丢弃所有液体。
用乙腈收缩凝胶片。
在50毫米碳酸氢铵中用55毫米碘乙酰胺代替乙腈。
室温下，在黑暗中孵育20分钟。
丢弃碘乙酰胺的解决方案。
用150-200uL 50 mM碳酸氢铵洗涤凝胶颗粒15分钟。
旋转凝胶颗粒，丢弃所有液体。
用乙腈收缩凝胶片。
为胶液消化
在含12.5 uL胰蛋白酶的消化缓冲液中，4°C(冰桶)再水化凝胶颗粒。在4°C孵育30 - 45分钟。
15 - 20分钟后，检查样品，如果所有液体已被凝胶片吸收，则添加更多的消化缓冲液(包括胰蛋白酶)。
取出并丢弃剩余的上清液。
加入5-25uL不含胰蛋白酶的缓冲液覆盖凝胶块，并在酶切过程中保持其湿润(37°C;过夜，至少6个小时)。
过夜孵育后，将上清液放入新鲜的Eppendorf管中。
加入0.4 %乙酸、0.02%七氟丁酸(HFBA) 50mL，搅拌提取15分钟。
重复两次。
池所有上清和储存消化在-20°C或进行过滤，脱盐和浓缩使用阶段提示。
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使用微尺度反相柱过滤、脱盐和预浓缩(阶段尖端)
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在3M Empore C18膜上用钝的20G针戳出一个小圆盘。
将反相盘转移到合适尺寸的移液器尖端，如Eppendorf的GELoader尖端，P10尖端或P200尖端(在我们手中，康宁尖端的锥形尖端已经被证明是非常有用的)。这可以很容易地通过将熔融二氧化硅毛细管插入针中完成。确保磁盘处于正确的位置，以便所有液体都必须通过磁盘。
如果需要对大量的物质进行脱盐和浓缩，可以在移液管尖端插入几个反向的圆盘。
用10 ul甲醇将膜浸湿。
用10 ul StaGE buffer A (0.4% HOAc和0.02 % HFBA在水中)处理C18磁盘。
在缓冲液A中重新溶解冻干样品，或在消化液中加入10倍缓冲液A (4% HOAc和0.2% HFBA溶于水)，以确保HOAc和HFBA的最终浓度与1倍缓冲液A相同。
使用空气压力(如一次性注射器)使液体通过3M Empore薄膜。
用10到50 ul级缓冲液A清洗磁盘。
用10 ul StaGE缓冲液B (0.4 % HOAc和0.02 % HFBA在80%乙腈中)将样品洗脱到合适的样品瓶中。
冻干样品，重新溶解于上样缓冲液中，用于后续的LC/MS分析。
或者，样品可以直接用基质溶液洗脱到MALDI目标上。
更多的细节，参见Rappsilber等人(2003)肛门。化学。75:663 - 670。
笔记
建议碳酸氢铵原液:1 M, 4°C保存。
建议DTT原液:1 M， -20°C保存。
建议碘乙酰胺原液:500mm， -20°C避光保存。
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