波士顿儿童医院近期和正在进行的研究

最近和正在进行的研究|概述

高吞吐量技术开发。

Alt实验室最近在PCMM方面的大部分工作是由他们在过去十年中开发的一套新的高吞吐量方法来研究dsb和染色体易位．首先，他们开发了高通量全基因组易位测序(HTGTS)，基于内源性基因组DNA dsb易位到设计内切酶引入的“诱饵”dsb的能力，精确绘制DNA dsb。他们对这种方法的应用最初为三维基因组中的染色体重排机制提供了重要的新见解。随后，Alt实验室在HTGTS中添加了线性扩增介导(LAM)步骤，以生成增强的、高分辨率的LAM-HTGTS方法．在此基础上，他们开发了一系列LAM-HTGTS方法，为V(D)J重组的研究提供了前所未有的灵敏度和分辨率本CSR5双边带加入。该实验室还开发了一种新的“3C-HTGTS”方法，允许以前所未有的分辨率映射长染色质域内的序列相互作用，这对研究特别有用染色质环挤压介导的基因调控．

V(D)J重组，IgH CSR和染色质环挤压。

概述:

Alt实验室在淋巴细胞中对两种不同的程序性重排机制(V(D)J重组和IgH CSR)的机制理解上取得了革命性的飞跃，发现染色体结构的全基因组调节过程在这两种机制中都起着重要作用。

他们发现这两种非常不同的重组过程发生在B淋巴细胞发育的不同阶段，都使用内聚物介导的染色质环挤压，使染色质长环穿过重组中心。对于每一种，环挤压导致顺式调控元件、底物DNA序列和启动酶的并置。值得注意的是，V(D)J重组和CSR也都包含了环挤压以促进连接序列的正确连接方向，尽管其机制不同。

V (D) J重组:

V(D)J重组组装了IgH可变区外显子，来自V、D和J基因片段，这些基因片段位于IgH位点上游2.7 Mb的簇中。V(D)J重组是由RAG1/2内切酶(“RAG”)启动的，它在两个要连接的基因段(如D和JH段)引入必要的DNA dsb。当RAG结合并在V(D)J位点下游端重组中心获得JH后，RC作为“动态子环锚”，将含有D的上游区域内聚体介导的环挤压呈现给RAG，这一过程在定向D到JH连接中起关键作用(V (D) J重组视频)形成DJH中间体。

中间的DJH形成一个新的RC，准备与上游和VHs连接，它们都面向删除连接。Alt实验室最近发现，在亲b细胞系模型中，通过下调两个内聚复合物因子(即CTCF或Wapl)的水平或活性，可以通过长(2.4Mb)含VH的IgH结构域的IgH位点VH到(D)J的重组，使V(D)J重组越过染色质障碍，进入环路，例如含有VH的上游区域前面或内部的大量CTCF结合位点(cbe)，从而进行发育调控。

此外，我们进一步发现，在骨髓前b细胞发育过程中，下调Wapl水平是促进VH在这一长上游染色质区使用的机制，从而产生不同的原代细胞抗体能唱．这种内聚体介导的环挤压调控的一般机制可能会影响IgH位点以外的基因表达调控，特别是跨长染色体距离的基因表达调控。

除了更详细地阐明IgH位点的位点收缩和rag -扫描机制外，我们还阐明了Igκ轻链位点的这种机制，这对连接模型有不同的约束。Igκ可变区外显子通过直接的k - k连接组合而成。与IgH位点不同的是，所有的VHs都指向DJH复合物的缺失连接，3Mb Vκ位点内的100多个Vκs相对于Jκ具有两个方向，因此，许多Vκ必须进行反向的V(D) κ连接，这与主导IgH位点V(D)J重组的严格线性RAG扫描不一致。然而，我们的初步研究确实暗示了环挤压介导的RAG线性扫描在Igκ V(D)J重组中的作用，尽管可能更有限或更集中。此外，我们进一步发现转化的pro-B细胞系中的Wapl水平足以阻碍VH位点的收缩和扫描，但仍然允许正常的收缩和扫描Vκ轨迹．目前正在进行的研究将进一步确定线性环突出介导的RAG扫描在vk和VH位点中促进V(D)J重组的机制，包括RC功能、染色质结构元素的潜在差异作用和/或复杂因子中内聚物的差异表达或修饰。在我们实验室和哈佛大学庄晓伟实验室的合作中，我们也在探索VH区域如何通过超分辨率成像与重组中心动态相互作用。

本企业社会责任:

在活化的成熟B细胞中，IgH CSR将最初表达的Cμ常量区外显子替换为IgH位点下游200kb部分6组其他常量区外显子中的一组，从而影响抗体效应子功能的变化。激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)通过在供体Sμ和下游受体S区短靶基序上产生脱氨损伤启动CSR。这些病变被DNA修复因子转化为dsb后。Alt实验室发现，Sμ DSB的上游端到受体S区DSB的下游端的程序化删除端连接完成企业社会责任．这些AID生成的dsb是如何被编程加入到缺失方向和反转方向的一直令人困惑。虽然人们普遍认为CSR DSB突触是通过扩散发生的，但这种机制很难与CSR的各种机制特征相一致，这意味着我们提出了一种“前所未有的”CSR DSB连接机制．我们最近的研究表明内聚体介导的环挤压是导致这一现象的根本原因机制．当前的Alt实验室CSR模型，以大量证据为基础，从静态的教科书观点(CSR的视频)．在B细胞激活之前，环挤压使远处的3'IgHRR与供体Sμ接近形成动态的CSR中心，潜在的受体CHs被隔离在挤压环中。细胞因子/激活因子在目标S区上游启动CH启动子，在通过CSR中心挤压时被3'IgHRR超级增强子激活。转录激活的ch -启动子加载内聚物，导致额外的挤压使激活的受体S区与Sμ区对齐。B细胞激活也诱导AID，它被转录招募到S区启动dsb。另外的研究结果支持末端连接模型，在该模型中，对立的内聚环将张力放在两个S区域之间对齐，每个DSB端单独卷绕到环中，阻碍挤压和对齐端deletional加入．

CSR项目正在进行的主要目标包括更直接地阐明内聚复合体蛋白在CSR机制中的作用，特别是在末端连接步骤中，以及评估相关的末端连接机制是否可能在其他环挤压受阻的基因组区域融合dsb，特别是在促进dsb增加或持续的环境中。

SHM和抗体亲和力成熟。

原代B细胞通过体细胞超突变(SHM)和生发中心(GC)的细胞选择经历抗原驱动的BCR亲和力成熟。我们最近发现，基于使用新的小鼠模型方法，组装的抗体可变区外显子存在于成熟GC B细胞基因组的一个特殊位置，促进体细胞高突变(SHM)过程涉及进一步的抗体可变区亲和力成熟．我们最近的其他研究进一步表明，内聚体介导的环挤压在这方面发挥了作用享有特权的位置我们正在积极调查这种可能性。上述的新型小鼠模型方法也使我们能够阐明序列内在突变与选择性突变在亲和成熟中的贡献HIV-1广泛中和抗体BnAbs．

虽然大多数GCs是短暂的，但肠道微生物依赖的肠道Peyer’s patch (PP) GCs是慢性的，对其BCR成分或SHM模式知之甚少。几个先前的小鼠模型研究的发现，包括我们在上面提到的模型中的研究，提出了PP gc是否是(至少部分)SHM介导的BCR多样化可能具有抗原非特异性的位点的问题，就像在鸡、羊和兔子中发生的那样。为了阐明生理性PP GC BCR成分，Alt实验室开发了一种新的基于高通量lam - htgts的图谱/SHM分析．通过该试验，他们发现来自不同小鼠的PP GCs扩展了公共克隆型，这些公共克隆型通常具有典型的IgH CDR3s，在naïve B细胞组中出现的频率远远高于预期，这是由于V(D)J重组过程中的连接偏差。一些公共克隆型依赖于肠道微生物群，编码对细菌聚糖反应的抗体，而另一些则不是。SPF级粪便转移到无菌(GF)小鼠恢复了细菌依赖性克隆型，直接影响BCR的选择。事实上，实验室在这种公共克隆型中反复确定了选择的SHMs，暗示了在内稳态条件下小鼠PP GCs的亲和成熟。因此，持续的肠道抗原选择复发的BCR克隆型种子慢性PP GC反应。

我们正在进行的工作将使用V(D)J敲入或敲除小鼠模型来测试上述PP GC抗体库研究的意义，即过表达或消除编码公共PP克隆型的IgH和IgL可变区域的表达，以检查对正常粘膜免疫稳态的潜在影响。我们还将阐明一些复发的公共BCR克隆型的目标，不是微生物依赖。此外，我们将把工作扩展到人类粘膜相关的淋巴组织。

我们新的基于lam - htgts的基因组/SHM分析也使实验室能够在人源化小鼠模型HIV-1疫苗研究的GC应答中监测这些参数。

研究疫苗方法诱导HIV-1基因的人性化小鼠模型。

为了避免先前人源化小鼠疫苗模型的潜在缺陷，Alt实验室继续开发新的人源化小鼠模型，以促进基于疫苗的方法的协作研究，以引出HIV-1广泛中和抗体(BnAbs)。

最近，在BMGF的支持下，该实验室开发了一种新型的人源化小鼠疫苗模型，用于有效的HIV-1型克隆抗体VRC01类，该模型基于一种策略，允许这类克隆抗体的人类前体IgH和Igκ可变区域外显子通过环突出介导的V(D)J重组进行强壮组装，并控制结果小鼠的B细胞库。实验室进一步在小鼠模型中引入了异位人TdT表达，因为TdT在人中表达，而在装配了Igκ可变区外显子的小鼠前体B细胞中不表达。强化TdT表达，通过n区添加，增加了小鼠模型中人类Igκ链可变区外显子CDR3s的多样性，使Igκ VRC01前体序列更接近人类。在这个“完整的”VRC01-重组模型中，单个B细胞表达众多不同的、总体上更像人类的VRC01前体中的一种。与合作者一起，该实验室此前发现，适当的免疫早期人源化小鼠VRC01小鼠模型促进了VRC01前体抗体的亲和成熟HIV-neutralizing抗体血统．最新的、完整的VRC01模型已经被许多实验室用于疫苗开发，预计在帮助指导或解释人体临床试验方面将更加有用。

实验室正在进行的其他相关研究集中在开发具有不同前体成分的小鼠模型，以测试其他HIV-1疫苗靶点的疫苗策略，包括HIV-1包膜蛋白上的V2顶点和V3聚糖靶点。针对这两类靶标的bnAbs的一个显著特征是它们含有长IgH可变外显子CDR3s，在20-30个氨基酸的范围内。这种IgH链的扩展CDR3s已经被其他人发现与厚聚糖盾下的聚糖和保守肽表位有关键的接触。这种长IgH链CDR3的需求为在人源化小鼠模型中进行疫苗试验带来了重大挑战，因为小鼠通常不会产生长IgH CDR3。作为解决这一挑战的第一步，该实验室开发了一个小鼠模型，在引入的人类VH、D和JH片段的V(D)J重组过程中产生长IgH CDR3s。该模型最终将被整合到V2顶点和V3糖基体IgH和IgL V(D)J重排模型中，以生成更多类似于人类的小鼠模型中这些BnABs的前体序列。

虽然上面概述的一般类型的动物模型对HIV-1疫苗领域很有用，但我们也使用这些模型的相关版本来多样化已知的治疗性人类抗体(如抗pd -1)的特异性和功能，或发现新的、潜在的治疗性人类抗体(如抗sars - cov -2刺突蛋白抗体)。这些研究也在进行中。

神经元前体细胞发育过程中的基因组不稳定性机制。

我们继续对导致发育中的大脑前体细胞基因组不稳定的因素进行长期研究，这些因素最初是由我们发现的N-Myc基因扩增所激发的。在我们发现XRCC4 C-NHEJ因子之后，我们发现它是淋巴细胞发育所必需的，因为它在V(D)J重组中起着义务作用，而且还专门用于神经(大脑)发育。在后者的背景下，xrcc4缺失导致新生成的小鼠神经元广泛的p53依赖性凋亡，因为它们无法修复神经祖细胞中的dsb。虽然p53缺失挽救了xrcc4缺失的神经元凋亡，导致小鼠死于成神经管细胞瘤，伴有复发的基因组重排，这是这种儿童脑癌侵袭性人类形式的特征。在这些表现型的基础上，用当时可用的技术无法识别假定的复发性dsb。然而，通过开发和应用基于lam - htgts的技术，我们在初级神经元干和祖细胞(NSPCs)全基因组中发现了27个健壮的、复发的DSB簇(RDCs)。强健的RDC发生在某些非常长的基因(“RDC基因”)中，这些基因具有后期复制、转录和编码调节神经元功能的蛋白质的功能。大多数RDC基因与神经发育和神经精神障碍和/或癌症有关。

最近与Gage实验室(Salk研究所)合作，在人类诱导多能干细胞衍生的人类神经前体中发现了36个长RDC基因，其中70%是同源的鼠标RDC基因．RDC基因对大脑发育和/或疾病的潜在影响已经被假设。我们正在进行的目标是通过测试这些假设来了解潜在的机制和体内影响。在这些研究中，我们建立了一个系统，在体外将有兴趣的靶向突变的ES细胞分化为神经元前体，以进一步研究其机制RDC代．我们还在研究一个基于es的系统，在体内NSPCs内生成诱饵DSB，以评估内源性RDC DSB频率，并确定体内应力对RDC形成的影响。最后，我们最近开发了一种基于ES细胞的前脑胚泡互补方法，类似于我们的许多免疫系统研究中仍然使用的rags缺陷胚泡互补方法，这应该有助于评估RDC重排传播到皮质/海马神经元的潜力，并最终探索潜在的生理和病理后果。

鼠标建模技术。

神经(前脑)囊胚互补。

(Chang *。、梁、Z *。、戴H-Q *。， Alt F.W.*和Schwer, B.*自然，2018)

*注:

上面描述的大部分“近期”工作正在进行中，并为合格的学生和博士后提供项目机会。

虽然在本网站报告中只引用了最近(过去5年)Alt实验室的出版物(带有超链接)，但在“出版物”中可以找到Alt实验室早期的重要贡献和其他实验室对所涵盖的一般研究领域的重要贡献的许多参考文献。

警告

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