服务|概述
如何启动服务
有兴趣的人士可与中心主任助理联络，讨论拟制作老鼠模型的初步方法。使用鼠标核心服务在BCH生成鼠标模型的主要要求是PI必须拥有所需模型的经过批准的IACUC和IBC协议。在获得批准后，小鼠核心将与PI或实验室成员协调提交申请表格，并在安排实验前提供所需试剂。
需求
- 认可的IACUC和IBC协议所需的小鼠模型。
- 提交由PI和指定实验室成员签署的服务电子申请表格(eForm)。
- 在安排实验前，小鼠核心将与PI或实验室成员协调收集所需的试剂。
- 用于偿还所请求服务费用的基金号或采购订单号。
你有什么问题吗?电子邮件形式transgenicmouse@childrens.harvard.edu而且Mantu.Bhaumik@childrens.harvard.edu
基因编辑服务
使用CRISPR/Cas9试剂编辑小鼠基因组。用户可选择设计引导RNA、供体模板或使用商业服务。我们强烈建议使用合成的导向RNA, PAGE纯化的单链寡核苷酸供体/s和Cas9蛋白。另外，如果双链供体构建物被用作供体模板，那么DNA必须按照下面所述进行纯化。由于gRNA的裂解效率不同，通常建议每个靶位点有2-3个gRNA在活的有机体内．
显微镜下注射服务
原核的注入
- 将CRISPR/Cas9试剂注入受精卵产生奠基人
- 单个或多个基因敲除
- loxp或frt使用单链寡核苷酸的floxed等位基因(ssODN)
- 使用ssODN引入特定的点突变
- 报告小鼠使用ds-Donor结构
- 使用ds-Donor结构的基因靶向奠基人
- 记者进入了ROSA26基因座
- 转基因DNA构建受精卵原核(B6, F1, FVB或突变株)
- 转基因BAC DNA构建到受精卵原核中
囊胚注射
- 基因靶向ES细胞引入宿主囊胚产生嵌合小鼠
- 将野生型或报告型ES细胞引入突变胚泡以产生嵌合小鼠
- 从KOMP/EUCOMM/IMMRC导入ES细胞株
- 小鼠诱导多能干细胞(iPSC)被引入囊胚
基因靶向在小鼠胚胎干细胞中的应用
利用PI构建基因靶向载体DNA，通过电穿孔和药物选择将其导入mES细胞。幸存的单株克隆体被采摘并在96个井中生长。将复制板的一半冷冻，另一半用于基因分型，以确定正确的同源重组事件。确认后，将阳性克隆进行扩增以备冷冻库存，并对正常染色体进行核型分析。经验证后，推荐2-3个独立克隆注入囊胚产生嵌合小鼠。在P21断奶后嵌合体转移到PI上。
我们还在mES细胞系中提供CRISPR/Cas9介导的基因靶向。
嵌合小鼠:我们已经证明了通过囊胚注射从不同小鼠品系产生嵌合小鼠的经验。我们提供C57Bl/6作为标准的囊胚供株，但是，我们提供使用Albino/B6的囊胚注射，需要额外的费用。输入的mES细胞必须检测为阴性支原体sp。
服务的事实
- 利用C57Bl/6 (JM8.A3.N1)、F1 (v6.5)或129Sv (J1)菌株的mES细胞通过同源重组(HR)进行基因靶向。用户可以选择克隆的数量选择96井格式和屏幕殖民地成功重组事件。
- 基因打靶在体外使用CRISPR/Cas9试剂也可作为微注射到受精胚胎的替代方案。
- 扩增同源重组鉴定阳性ES克隆
- ES细胞核型分析
转基因小鼠的服务
用户设计和创建转基因DNA结构，通过原核微注射生成创始人小鼠。我们建议使用Qiagen - free endotoxin max - prep或任何等效试剂盒来制备质粒DNA或使用核心提供的质粒DNA制备服务。通过限制性内切酶从质粒骨架中释放出转基因结构，转基因DNA在核心处被琼脂糖凝胶纯化，以确保成功生成创始人小鼠的试剂质量可控。
我们将在0.5天对受精卵进行前核微注射post-coitum用纯化的转基因DNA或CRISPR/Cas9试剂，将微注射的胚胎转移到受者寄养的雌性。大约3周后幼崽出生，并在P7或P8进行尾部活检以进行基因分型。在P21断奶前必须提供基因分型结果。经ARCH或接收机构批准后，已识别的创始人转移给研究者。
我们的目标是提供至少两个创始人/转基因结构或CRISPR项目。如果两个创始人不能通过两个阶段的微注入实现，那么我们将执行额外的阶段，以收取额外的费用。低温贮藏
冷冻保存，体外受精和再植服务
胚胎/精子/细胞系储存服务表格[下载PDF]
胚胎冷冻保存服务电子表格[下载PDF]
精子冷冻保存服务电子表格[下载PDF]
再派送服务表格[下载PDF]
小鼠菌株的冷冻保存方法是将胚胎或精子冷冻在高安全的无菌吸管中，并保存在IMV Cryo-Bio存储系统的液氮下。
请注意，冷冻保存服务只提供给在ARCH设施内的小鼠群体。
胚胎冷冻保存:研究人员提供6-10个经过生育能力测试的杂合子或纯合子雄性，用于与野生型捐卵雌性交配以获取胚胎。如果来自同一品系的雌性供卵者用于交配，那么研究者有责任提供3-4周龄的雌性供卵者。在收集和冷冻所需数量的胚胎后，通过解冻胚胎并将其重新植入养母，以确定恢复，允许妊娠并通过活产确认。
在高安全性的无菌吸管中，胚胎在8细胞期的冷冻保存有三种选择。每根吸管包含20-30个胚胎，储存在IMV冷冻生物系统高脚杯中。
1) 100-150个胚胎-快速和经济的选择来保存一个菌株(Cryo-1)
2) 150-300个胚胎-偶尔恢复的品系长期储存(Cryo-2)
3) 300-450个胚胎——一个品系的大胚胎库，用于存储，如果预期定期恢复或未来分配(Cryo-3)。
精子冷冻保存:也可用于保存小鼠品系。然而，由于男性冷冻/解冻精子的高变异性，无法保证恢复。我们需要三名经过生育能力测试的男性，用于获取精子，并存储在高安全的无菌吸管中。通常5-8吸管/男性冷冻。通过使用野生型捐卵女性进行体外受精，并将受精卵移植到养母体内，然后进行活产，测试恢复。
ES细胞推导:我们提供从转基因，基因靶向或任何其他小鼠模型的ES细胞系衍生。PI为男性和女性提供收获囊胚和建立ES细胞系。细胞系的总数取决于从特定菌株中获得的囊胚的质量和数量。
服务的事实
- 8细胞期胚胎冷冻保存在液氮中
- 精子冷冻保存是通过用2-3个经过生育能力测试的雄性收集精子和在液氮中冷冻保存的精子来实现的
- 活的幼崽被在体外使用冷冻精子受精
- 对年龄/性别/基因型匹配的人群使用新鲜精子进行体外受精
- 通过胚胎移植或体外受精重新衍生输入的小鼠品系
配套服务
- 用于微注射或基因靶向的转基因DNA构建、纯化、质量和数量分析
- 从96孔到10 cm板的ES克隆中提取DNA
- 小鼠尾巴DNA提取
- 用丝裂霉素- c处理小鼠原代胚胎成纤维细胞作为mES喂养层
- 小鼠胚胎在E7.5- E18.5获得
- 从突变鼠株中建立mES细胞系
- 进口精子或胚胎储存在液氮罐中。
定价
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