有用协议|概述
避免污染
- 角蛋白污染几乎总是作为背景蛋白被观察到。为减少污染，请只戴无粉丁腈手套，并使用HPLC级水冲洗所有接触凝胶的托盘、容器和表面(包括手套、染色盘、手术刀、剃须刀片、灯箱和切割区域)。凝胶应储存在4°C的1%醋酸/HPLC或dd H2O中，或0.02%叠氮化钠中。使用以前未使用过的存储容器/凝胶托盘来存储用于质谱分析的凝胶。
- 我们强烈建议在制备样品进行质谱分析时使用新制备的溶液/缓冲液。
- 其他常见的污染蛋白是生物实验室常用的干牛奶、培养基和/或血清中的酪蛋白和牛血清白蛋白。这些蛋白质污染可以通过大量清洗细胞颗粒、玻璃器皿和托盘来大大减少。
- 来自洗涤剂、PPG和/或PEG的聚合物是另一个常见的污染源。因此，在要消化的样品中不应存在洗涤剂以进行质谱分析。许多肥皂和护手霜含有聚乙二醇化合物，所以用刚洗过或涂过护手霜的手接触管、托盘或凝胶会产生聚合物污染。
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蛋白质沉淀
- 向样品中加入最终浓度为20 ug/ml的糖原(糖原不干扰后续的SDS-PAGE)。
- 加入最终浓度为0.1 M, pH值为5的醋酸钠。
- 加入3体积的乙醇。
- 漩涡。
- 在室温下放置2-3小时。
- 不应该有任何可见的沉淀物!
- 旋转10分钟在RT以14 krpm。
- 用70%乙醇清洗颗粒。
- 在装载缓冲液中溶解颗粒。
注意:
如果离心前总混合液中有明显沉淀，说明:a.蛋白质溶液中盐含量过高;B.一定量的蛋白质(-s)会因不溶性而丢失。
为了避免这个问题:
- 省略乙酸钠。
- 将蛋白质混合物的盐摩尔浓度降低到300-400mM。
- 在Eppendorf管中用水将蛋白质稀释至500ul
- 添加:50ul DOC, 25 ul Triton X 100, 80 ul TCA (13% TCA)
- 在冰上孵育至少2小时。
- 在台式微型离心机中以14000转/分的速度在4℃下旋转30分钟。
- 管子的一侧会有片状颗粒。
- 除去上清液，用KimWipe擦拭器将试管倒置，让试管立着，以除去大部分液体。
- 加入500ul乙醇/乙醚或冷丙酮。在声波浴中对样品进行声波处理，以彻底破坏颗粒。
- 在冰上孵育30分钟。
- 重复步骤4。
- 几乎不会有颗粒。
- 重复步骤6。
- 让空气在室温下干燥。
- 先在5ul运行缓冲液中重新悬浮样品，然后是20ul样品缓冲液。
- 在65°C孵育15分钟。
- 加载样品并运行凝胶。
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在溶液中消化
对于溶液内消化和随后的质谱分析，样品应不含任何洗涤剂(SDS, Triton X100, NP-40等pp.)。一旦投保，可以使用以下协议:
- 应调整溶液的pH值，使pH值介于7.2和8.5之间。
- 将胰蛋白酶添加到样品溶液中，使酶与底物的比例在1:50至1:10范围内。
- 37°C孵育4 - 8小时(或过夜)。
如果需要变性、ss键的还原和游离巯基的烷基化，我们建议采用以下方案:
- 沉淀蛋白质(见上文)。
- 在8 M尿素，50 mM碳酸氢铵，20 mM DTT中重新溶解蛋白质。
- 56℃孵育30分钟。
- 冷却至室温。
- 加入最终浓度为100 mM的碘乙酰胺溶液，在室温下黑暗中孵育20分钟。
- 使用Pierce公司的Slide-A-Lyzer透析MINI装置(MWCO 3500)对10mm碳酸氢铵透析过夜。
- 根据蛋白质浓度的不同，可以直接向样品溶液中添加胰蛋白酶，使酶与底物的比例在1:50至1:10范围内，也可以快速分离样品，然后在50mm碳酸氢铵中重新溶解蛋白质，并加入适量的胰蛋白酶。
- 37°C孵育4 - 8小时(或过夜)。
SDS-PAGE前的溶液还原/烷基化
- 将最终浓度为20mm的DTT添加到样品缓冲液中(确保样品缓冲液中不含有额外的DTT或bME)。
- 在65°C孵育20分钟。
- 让其冷却至室温。
- 加入碘乙酰胺，最终浓度为100毫米。
- 在室温下在黑暗中孵育20分钟。
- 如果溴酚蓝的颜色变为偏绿/偏黄，则加入1微升1M Hepes或Tris (pH值7.5 ~ 8.8)调整pH值。
- 加载并运行凝胶。
或者，可以使用以下协议:
- 将最终浓度为20mm的DTT添加到样品缓冲液中(确保样品缓冲液中不含有额外的DTT或bME)。
- 在65°C孵育20分钟。
- 让其冷却至室温。
- 加入丙烯酰胺溶液，最终浓度为样品体积的1%。
- 室温下孵育20分钟
- 加载并运行凝胶。
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凝胶染色
有许多染色方法可与随后的蛋白水解消化和质谱分析兼容。大多数是基于考马斯色染色，银染色或使用荧光染料，如Sypro Ruby或Sypro Orange。考马斯染色方法简单、廉价，但灵敏度有时不够。银染色克服了考马斯染色的灵敏度限制，但相当麻烦。将考马斯氏染色的容易性和银染色的敏感性结合在荧光Sypro染料中。然而，它们的缺点是相当昂贵，荧光扫描仪是成像的先决条件，切除感兴趣的凝胶塞/带需要便携式紫外线源。无论使用何种染色方法，在染色过程中避免不可逆地固定凝胶中的蛋白质是至关重要的;这一考虑尤其适用于一些使用戊二醛或甲醛进行固定和显影的“传统”银染色方案，这将使凝胶与后续的质谱分析不兼容。下面给出了各种质谱兼容的银染色方案。
我们拥有丰富的商业考马斯氏染色试剂盒的经验，包括Pierce的GelCode蓝染色试剂盒，Bio-Rad的Bio-Safe考马斯氏染色试剂盒和Invitrogen的胶体蓝染色试剂盒。一般考马斯染色方法如下所示。如果使用商业试剂盒，我们强烈建议遵循制造商的协议。
Coomassie染色
- 永远戴无粉手套!不要用裸露的皮肤接触凝胶。
- 在制备染色缓冲液时，一定要使用ddH2O或商用HPLC级水。
- 从卡带中取出凝胶，用ddH2O冲洗缓冲液。
- 用45%甲醇、10%乙酸和45% ddH2O固定凝胶15-60分钟。
- 用ddH2O冲洗凝胶5分钟，重复两次。
- 用考马斯蓝溶液覆盖凝胶。
- 轻轻摇晃3小时。
- 用ddH2O冲洗凝胶5分钟，重复两次。
- 用45%的甲醇、10%的醋酸和45%的二氢二水浸泡一夜。
- 用ddH2O冲洗凝胶5分钟，重复两次。
- 用干净的保鲜膜包裹凝胶。用台式扫描仪获取凝胶图像。
- 将凝胶保存在1%的醋酸中或0.02%的NaN3(叠氮化钠)ddH2O中。
银染色
- 永远戴无粉手套!不要用裸露的皮肤接触凝胶。
- 在制备染色缓冲液时，一定要使用ddH2O或商用HPLC级水。
- 从卡带中取出凝胶，用ddH2O冲洗缓冲液。
- 用45%甲醇、10%乙酸和45% ddH2O固定凝胶15至60分钟。
- 将凝胶放入ddH2O中摇一小时。延长洗涤时间有助于消除凝胶冲洗时间过长后经常出现的淡黄色背景(参见本方案的第6步)。
- 用0.02%的硫代硫酸钠使凝胶增敏1 - 2分钟。轻轻搅拌，以确保凝胶板被均匀覆盖。丢弃溶液，用两次水快速冲洗凝胶板(每次10秒)。
- 将凝胶在冷却的0.1% AgNO3中在4°C(冰箱)中孵育30分钟。
- 丢弃硝酸银溶液，用两次水快速冲洗凝胶(每次30秒)。
- 用0.04%的新鲜甲醛和2%的碳酸钠*冲洗凝胶。显影液变黄后立即丢弃，用新鲜的部分替换。
- 当染色达到一定程度时，丢弃显影液，用1%的醋酸代替，以淬灭污渍。用1%醋酸清洗凝胶多次，然后用1%醋酸/ddH2O保存。或者，凝胶可以储存在0.02% NaN3(叠氮化钠)的ddH2O中。
- 注意:在某些情况下，染色蛋白带的颜色可能会随时间发生轻微变化。然而，这些变化不影响质谱测序结果。有关更多细节，请参见Blum等人，电泳，8,pp93-99, 1987和Schevchenko, A. et al. (1996) Anal。化学68,850-858。
SYPRO红宝石染色
- 永远戴无粉手套!不要用裸露的皮肤接触凝胶。
- 在制备染色缓冲液时，一定要使用ddH2O或商用HPLC级水。
- 使用干净的塑料托盘作为染色容器。
- 用ddH2O冲洗凝胶3次。
- 用10%甲醇、7%乙酸和83% ddH2O固定凝胶60分钟。
- 在SYPRO Ruby溶液中染色凝胶，该溶液至少是凝胶体积的10倍。
- 轻轻摇动至少3小时，最多可达一夜，以达到最大的敏感度。
- 用10%甲醇、7%乙酸和83% ddH2O清洗凝胶30-60分钟，以降低背景荧光。
- 用ddH2O清洗凝胶3 - 5分钟。
- 在蓝光透光器下获取凝胶图像(可通过手持UV光源查看图像)。
- 将凝胶保存在1%的醋酸或0.02%的叠氮化钠中。
- 注:SYPRO Ruby是乙二醇和脂蛋白的次优选择。
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去除凝胶带
- 用milliq或HPLC级水冲洗凝胶。用干净的手术刀切除感兴趣的带子。为了减少“背景”凝胶的数量，剪得尽可能靠近带子的边缘。
- 将切除的带子切成大约1 x 1毫米的碎片，并将凝胶颗粒转移到0.5 ml的微量离心管中。不要浸渍胶带/胶塞。
减少凝固态/烷基化
- 用100- 150l milliq或HPLC级水清洗凝胶颗粒5分钟。旋涡短暂，向下旋转凝胶颗粒，丢弃液体。
- 加入乙腈(大约相当于凝胶片总体积的3 - 4倍)，孵育10 - 15分钟，直到凝胶片收缩，变得不透明并粘在一起。旋转凝胶颗粒，丢弃所有液体。
- 将凝胶块在10mm DTT/ 50mm碳酸氢铵中膨胀，在56°C下孵育30分钟，以减少蛋白质。
- 旋转凝胶颗粒，丢弃所有液体。用乙腈收缩凝胶片。
- 在50mm碳酸氢铵中用55mm碘乙酰胺代替乙腈。在室温下在黑暗中孵育20分钟。
- 丢弃碘乙酰胺溶液。用150- 200l 50mm碳酸氢铵清洗凝胶颗粒15分钟。旋转凝胶颗粒，丢弃所有液体。用乙腈收缩凝胶片。继续胰蛋白酶消化(见下文)。
为胶液消化
- 在冷冻消解缓冲液(50mm碳酸氢铵在HPLC级水中)中再水化凝胶颗粒，含12.5 ng/?L胰蛋白酶在4?C(在冰上或在寒冷的房间里)。
- 4°C孵育30 - 45分钟。15 - 20分钟后，检查样品，再加入12.5 ng/?L胰蛋白酶覆盖凝胶颗粒，如果他们已经吸收了前一种。
- 除去并丢弃剩余的上清液。在HPLC级水中加入足够的(5-50 uL) 50mm碳酸氢铵(不含胰蛋白酶!)，以覆盖凝胶颗粒，并在酶裂解过程中保持湿润。在37°C下孵育凝胶颗粒至少6小时(最好是过夜)。
- 孵育后，在新鲜的Eppendorf管中回收上清液。
- 加入50l 0.4%醋酸，0.02%七氟丁酸(HFBA)，搅拌萃取15分钟。重复两次。
- 收集所有上清液并在-20°C保存消化液或使用StaGE尖端进行过滤、脱盐和浓缩。
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微型反相柱过滤、脱盐和预浓缩(端部)
- 用20G钝针在3M Empore C18膜上打孔。
- 将反相盘转移到适当大小的移液管尖端，如Eppendorf的GELoader尖端，P10尖端或P200尖端(在我们手中，锥形尖端的康宁尖端已被证明非常有用)。这可以很容易地完成使用熔融二氧化硅毛细管插入针。确保磁盘是正确的定位，这样所有的液体必须通过磁盘。
- 如果需要脱盐和浓缩大量的物质，可以在移液管尖端插入几个反相盘。
- 用10ul甲醇浸湿膜。
- 用10 ul的StaGE buffer A (0.4% HOAc和0.02% HFBA在水中)调节C18磁盘。
- 将冻干的消化液重新溶解在A级缓冲液中，或在消化液中加入10倍A缓冲液(4% HOAc和0.2% HFBA在水中)，以确保HOAc和HFBA的最终浓度与1倍A级缓冲液相同。
- 通过施加气压(例如一次性注射器)迫使液体通过3M Empore膜。
- 用10到50 ul的StaGE buffer A清洗磁盘。
- 用10 ul StaGE缓冲液B (0.4% HOAc和0.02% HFBA, 80%乙腈)将样品洗脱到合适的样品瓶中。
- 将洗脱样品冻干，在加载缓冲液中重新溶解，用于后续的LC/MS分析。
- 或者，样品可以用基质溶液直接洗脱到MALDI靶上。
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笔记
- 建议碳酸氢铵原液:1m，储存在4°C。
- 建议DTT原液:1m， -20°C保存。
- 建议碘乙酰胺原液:500mm， -20°C暗处保存。